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摘 要
Ambr®250，是用于细胞(如CHO)培养的优秀自动化反应器平台，促进了培养工艺开发与表征研究工作。但由于细胞之间基因差异，在培养细胞与基因治疗产品的细胞(如T细胞)时，所需要的流体动力学特性与培养CHO细胞有显著区别，常规的Ambr®250反应器(双桨+挡板)用于培养此类细胞时，其所提供的流体环境并非最优，限制了细胞生长。基于此，Sartorius在原来的反应器容器上进行专项优化，并进行细胞培养试验验证。结果表明，新型Ambr®250反应器(单桨+无挡板)更有利于微载体悬浮培养并改善细胞培养系统，从而获得了更高的细胞密度。
关键词：Ambr®250反应器容器、T细胞、人间质干细胞(hMSC)、计算流体力学(CFD)
背 景
常规的Ambr®250反应器配备双桨+四块挡板，这种反应器广泛应用于CHO细胞培养并取得了良好的培养效果。但该反应器用于培养细胞与基因治疗产品的细胞时(如hMSC、T细胞，此类细胞往往需要添加微载体/活化磁珠)，难以将微载体充分悬浮，导致细胞生长受阻。如果只是单纯的增加搅拌转速，又存在细胞损伤风险。为解决该问题，Sartorius拟定方案进行测试，利用计算流体动力学(CFD)模拟辅助分析，并通过细胞培养试验验证，开发出一款真正适合此类细胞培养的Ambr®250反应器。
方案拟定与确认
在常规Ambr®250反应器容器培养人间充质干细胞(MSC)时，常常发现所使用的微载体难以悬浮，并且可以观察到容易聚集在挡板附近，这使得细胞难以附着在微载体上，影响了细胞正常生长。该现象表明，挡板不利于微载体悬浮细胞培养，所以第一个改进优化项便是去除挡板。
搅拌桨是反应器的核心，其几何形状对流场影响较大，因此除了挡板之外，还需要进一步优化搅拌桨。对Ambr®250反应器桨型重新设计，期望找到更适合微载体悬浮细胞培养的搅拌桨。拟定了8个方案，如图1所示。
图1.桨型设计方案(左：CAD画图；右：基本几何形状)
使用这8个新型搅拌桨型的Ambr®250反应器进行微载体悬浮试验，即将微载体分别加入含有一定体积水溶液的容器中，提高搅拌转速至恰好能将微载体悬浮，结果见表1。从结果中不难发现，Paddle和象耳桨A所需要的搅拌转速和能量最小，换言之，使用这两种桨搅拌在低转速条件下更容易使微载体悬浮。同时考虑细胞剪切损伤，根据Kolmogorov尺度λ，Paddle和象耳桨A(Elephant ear A)所对应的尺度更大，细胞更不容易损伤，这对于剪切敏感型细胞尤为重要。但考虑到Paddle桨是一种径向流桨，一般不用于动物细胞培养，此外，根据象耳桨C、D方案获得的测试结果可知，增加桨叶对微载体悬浮作用有限，因此轴向流象耳桨A(单桨)可能是最佳方案。
表1 微载体悬浮实验结果
JS:刚好能悬浮
CFD模拟分析
在初步确认象耳桨A方案后，使用CFD软件进行流场模拟分析，创建模型，设置转子域，划分网格，采用标准湍流k-e模型进行单相流模拟，如图2所示。其流场结果见图3，可以看到相较于有挡板的反应器设计，无挡板反应器搅拌桨下方的流体运动更充分，能够给该区域带来更大能量促进位于此处的微载体悬浮，这也解释了为什么常规Ambr®250反应器容器培养下，微载体难以悬浮。结合先前的实验测试结果，基本可以确认无挡板+单象耳桨A是优方案。
图2.转子域与网格创建(象耳桨A方案)
图3.象耳桨A流场模拟(左：有挡板；右：无挡板)
细胞培养验证
在锁定理论最佳反应器后，进行T细胞和人间充质干细胞(MSC)培养试验，以确认使用改进优化后的Ambr®250反应器培养这两种细胞能否获得更优的培养效果。具体细胞培养方案如下(表2，表3)：
表2 T细胞培养方案
表3 人间质干细胞培养方案
实验结果
如图4、5所示，相较于原始反应容器、T175瓶及转瓶，使用新型单桨无挡板的反应器容器进行细胞培养可以获得更高的细胞密度，该结果表明，新型Ambr®250反应器更适合培养T细胞/人间充质干细胞这类需要磁珠/微载体辅助的细胞。
图4.T细胞培养结果
图5.人间充质干细胞培养结果
结 论
赛多利斯从细胞培养本质出发，结合T细胞/人间充质干细胞(MSC)工艺特点，分析原始反应容器不足后进行优化设计并测试，借助CFD模拟辅助手段，在多种设计方案中快速锁定优方案。最终细胞培养实验表明，使用新型Ambr®250反应器培养细胞，细胞密度会显著高于改良优化前的反应器，甚至要优于T175瓶/转瓶。该反应器与T细胞/人间充质干细胞这类需要磁珠/微载体培养的细胞适配性好，能够帮助用户实现快速工艺开发。
参考文献
Rotondi, Marco et al. “Design and development of a new ambr250® bioreactor vessel for improved cell and gene therapy applications.” Biotechnology letters vol. 43,5 (2021): 1103-1116. doi:10.1007/s10529-021-03076-3
Costariol E et al (2019) Establishing the scalable manufacture of primary human T-cells in an automated stirred-tank bioreactor. Biotechnol Bioeng 116:2488–2502.
Keller, Marco et al. “CFD‐Aided and Experimental Characterization of Bioreactors under Low Power Input Conditions.” Chemie Ingenieur Technik (2022): n. pag.
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